乳腺癌肿瘤分型文献

邵志敏教授团队的乳腺癌分型文献，主要包括：

• Molecular classification of hormone receptor-positive HER2-negative breast cancer. Nat Genet. 2023
• Subtyping-based platform guides precision medicine for heavily pretreated metastatic triple-negative breast cancer: The FUTURE phase II umbrella clinical trial. Cell Res. 2023
• Metabolic-Pathway-Based Subtyping of Triple-Negative Breast Cancer Reveals Potential Therapeutic Targets. Cell Metab. 2021
• Genomic and Transcriptomic Landscape of Triple-Negative Breast Cancers: Subtypes and Treatment Strategies. Cancer Cell. 2019

Genomic and Transcriptomic Landscape of Triple-Negative Breast Cancers: Subtypes and Treatment Strategies -- Cancer cell

主要发现：

• 绘制了 465 个中国人群的三阴性乳腺癌的基因组和转录组图谱
• PIK3CA 突变和染色体 22q11 位置的拷贝数扩增在中国人群中比 TCGA 中更高频
• 利用转录组将 TNBC 分成了四个亚型，并且找到了每个亚型潜在的治疗靶点和生物标志物

TNBC 的定义：不表达雌激素受体蛋白（estrogen receptor， ER），不表达孕激素受体蛋白（progesterone receptor，PR）以及没有 ERBB2 扩增（这个基因之前叫做 HER2，human epidermal growth factor receptor 2，人表皮生长因子受体 2）。TNBC 大概在乳腺癌病人中占比 10% ~ 20%，常在年轻病人中发现，并且肿瘤的表型更加恶性。

504 个病人样本，通过质控的样本有 465 个病人样本，其中的组学信息如下：

中国人群 TNBC 的体细胞基因组变异

排名靠前的突变（SNV 和 INDEL）为 TP53 (74%), PIK3CA (18%), KMT2C (7%), 和 PTEN (6%)。PIK3CA, PTEN, 和 PIK3R1 富集在 LAR 亚型中（HRAS 和 ERBB2 也是，但是这两个基因的变异频率较少，只有 2%，特别是 ERBB2，仅有的 5 个突变都是在 LAR 亚型的样本中）。通过 GISTIC 分析显著被拷贝数影响的癌基因，发现 MYC 基因是被体细胞拷贝数影响最大的基因，在 81% 的样本中都发生了扩增，剩下的包括：扩增 E2F3 (55%), IRS2 (49%), CCNE1 (47%), EGFR (47%), NFIB (44%), CCND1 (44%), 和 MYB (41%) 以及缺失 CHD1 (71%), PTEN (58%), RB1 (54%), 和 CDKN2A (43%)。

PIK3CA 突变和染色体 22q11 位置的拷贝数扩增在中国人群中比 TCGA 中更高频。

将这篇文章发现的亚型和 TCGA 的数据进行对比（使用的是 nearest shrunken centroids method，最近收缩质心分类法），发现中国人群的 LAR 亚型比例要显著比 TCGA 样本要高（African American 和 Caucasians），并且在 TCGA 中只有 9 个三阴性乳腺癌是亚洲人，其中三个是 LAR 亚型。

基于多组学鉴别 TNBC 亚型

基于表达谱进行层次聚类，依据层次聚类的拐点图判断最佳聚类数为 4，然后使用 k-means 将 360 个有表达谱信息的 TNBC 样本基于 SD （方差）top 2000 基因的表达聚成 4 类：

• 腔内雄激素受体亚型（luminal androgen receptor, LAR），雄激素受体信号比较活跃，占 23%
• 免疫调节亚型（immunomodulatory，IM），免疫细胞信号和细胞因子信号基因表达较高，占 24%
• 基底样和免疫抑制亚型（basal-like and immune-suppressed，BLIS），细胞周期和 DNA 修复基因表达上调，免疫反应基因表达下调，占 39%
• 间充质样亚型（mesenchymal-like，MES），乳腺干细胞通路比较活跃，占 15%

这个分型结果和 2015 年 Lehmann 等人提出的相关性比较高：

作者也基于 CNV 的 GISTIC peak 以及突变 signature 进行聚类分别识别拷贝数亚型和突变亚型，并分析了这几个组学亚型之间的关联。这三个组学亚型的生存都没有明显差异，但是 IM 在校正了 lymph node status 和肿瘤大小后与较好的预后显著相关。

在 LAR 亚型中 ERBB2 和细胞周期信号通路激活

为了找到四个亚型的潜在治疗靶点，作者鉴别了亚型特异的基因组变异。在 LAR 亚型中 ERBB2 非同义突变比较富集，这些 ERBB2 的变异包括四个功能性位点：

虽然这 5 个病人都没有通过免疫组化和荧光原位杂交观测到 ERBB2 阳性；但是通过 GSVA 分析 ERBB2 通路的 signature 值发现有着 ERBB2 突变的病人的 ERBB2 通路活性更高（估计也没有什么显著性，所以放一个这种图）：

作者接着在他们医院找了 58 个经过免疫组化检测雄激素受体阳性的 TNBC 病人（和 LAR 类的特征类似），发现其中 8 个病人有着 ERBB2 突变（这也没有说明这些病人 ERBB2 是阳性的，这个证据有点牵强）。

尽管 LAR 亚型有着更少的 CNA，但是富集 Chr9p21 丢失，而这个染色体拷贝数变异影响着 CDKN2A 基因，这个基因是调控细胞周期的关键基因，在 65% 的 LAR 亚型样本中有着 CDKN2A 基因的丢失（其他亚型是 36%），基因表达也是同样的结论，因此有着 LAR 亚型的 TNBC 可能对 CDK4/6 抑制剂或者其他细胞周期抑制剂药物敏感。

IM 亚型是应用免疫检查点抑制剂疗法的潜在生物标志物

尽管 IM 亚型的预后较好，但是仍有 6% 的病人在术后 5 年内发生了复发或转移，这个亚型的特征是免疫细胞信号上调。HE 染色也证实了这类病人基质和肿瘤内浸润淋巴细胞的增多。IM 亚型和其他亚型之间的 TMB 并没有显著差异。GSEA 分析表明相较于其他亚型，IM 亚型中的 adaptive immune system 和 interferon g-related 的通路显著激活，另外使用 CIBERSORT 和差异基因分析表明 IM 亚型富集免疫激活细胞和免疫刺激基因表达：

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这些证据表明 IM 亚型是可以被免疫识别的，但是发展成了肿瘤，应该有某种免疫逃逸机制，可能是招募了免疫抑制细胞或者激活了免疫检查点分子，通过分析发现免疫抑制细胞没有在 IM 亚型中发生上调，但是一些免疫检查点分子和免疫抑制基因的表达发生了上调（如 IDO1，PDCD1，LAG3 等）：

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因此 IM 亚型可能适用于免疫检查点抑制剂疗法。

进一步基于 HRD 值对 BLIS 亚型进行分类

BLIS 是有着差预后和缺乏免疫激活的亚型，因此不适用于免疫检查点抑制剂疗法。前面基于突变 signature 聚类得到的 有着 HRD signature（signature 3）的亚类中有 65% 的病人都是 BLIS 亚类的，因此 HRD 的生物标志物可能对 BLIS 的治疗有帮助。依据 Timms 等人开发的 HRD score，发现 BLIS 亚型有着更高的 HRD score（其实差异不是很大），然后按照 41.64 作为阈值将样本分为 HRD-high 和 HRD-low 两组，发现这两组生存有差异：

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3例复发的 HRD-high BLIS 患者中有 1 例中心接受了后续治疗，但是肝和脑转移对铂类化疗和放疗均高度敏感，患者获得了完全缓解。

基于这些数据作者得出结论：有着高 HRD 的 BLIS 亚型患者可能会从针对 DNA 损失的治疗中获益，比如铂类药物的化疗，对于低 HRD 的 BLIS 患者没有特定的治疗方案，因此在复发时应考虑参加临床试验。

JAK/STAT3 通路在 MES 亚型中上调

通过表达谱分析表明 MES 亚型显示出乳腺癌干细胞的特性，因此作者关注 JAK/STAT3 通路，这个通路在乳腺 CSC 维持中起着关键作用。MES 亚型中 JAK1 和 IL6 基因的表达比其他亚型要显著高，这两个基因是 JAK/STAT3 通路激活的驱动基因：

另外 pSTAT3 signature 值在 MES 亚型中也要高，这些结果说明在 MES 亚型中 JAK/STAT3 通路是激活的，因此这个亚型可能对 JAK1/2 抑制剂 ruxolitinib 或者 STAT3 抑制剂药物敏感。

一张表总结下不同亚型的临床，基因组特征以及潜在的治疗策略：

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方法没有什么特殊的，其中聚类方法为一致性聚类加上 k-means 聚类，另外还使用了 nearest shrunken centroids method（ 见 最近收缩质心分类法（nearest shrunken centroids method））将 TCGA 样本基于这篇文章的类别进行分类。虽然这篇文章找到了几个分类，并将其与临床治疗联系，但是证据都不是很充足。

Molecular Subtyping of Triple-Negative Breast Cancers by Immunohistochemistry: Molecular Basis and Clinical Relevance -- The Oncologist

这篇文章使用免疫组化（IHC）的标志物将样本分成了 5 个分子亚型，并且将这些分子亚型与上一篇文章基于转录组分的亚型进行了对应（基本一致），从而使得这个分型更具有临床应用价值。

基于基因表达谱的TNBC分子亚型分类对于理解这种异质性疾病的分子本质以及指导个体化治疗至关重要。然而目前尚未将其用于指导临床实践中的治疗，因为尚无前瞻性临床试验的结果支持基于亚型的治疗策略对患者的益处。进行此类临床研究的主要挑战包括高昂的成本、复杂的技术过程以及基因表达谱的潜在批次效应。因此有必要采用一种简化的方法，将 TNBC 分类为分子亚型，以进行大型临床试验，从而最终应用于临床实践。

选用的样本是上一篇文章的有转录组数据的 360 个样本中的可以进行组织石蜡切片的 210 个样本，并且收集了额外的 183 和 214 个样本作为独立验证集来检测分类方法的效果，所有进行免疫组化分析的样本都没有接受过新辅助治疗。

对石蜡包埋的肿瘤组织切片进行免疫组化染色，基于染色结果对肿瘤样本进行分类，使用 Cohen κ 统计量来分析基于 IHC 的分类结果和基于转录组的分类结果之间的一致性。

筛选 marker 的流程：

1. 使用 DEseq2 鉴别在每个亚型中显著高表达的基因（log2FC > 1.5 并且 校正后的 P 值 < 0.05）

2. 使用 TCGA 的转录组和蛋白表达数据（质谱数据，从 cBioPortal 中可以下载）来检测第一步中得到的基因的 mRNA 和蛋白表达之间的相关性，保留相关系数大于 0.5 并且 P 值小于 0.05 的基因

3. 利用 ROC 分析来检测使用这些基因预测相应的亚型的能力（即将基因的表达视为预测值，标签为样本是否属于该亚型，计算 ROC 值），保留每个亚型中 ROC 值排名前 10 的基因

4. 人工选择 marker 基因：

   1. CD8A 和 FOXC1 是排名最高的基因，因此被选中为 IM 和 BLIS 亚型的 marker
   2. 在 LAR 亚型中雄激素受体信号比较活跃（上一篇文章），AR 也是临床上的一个靶点，另外有一些研究表明通过 IHC 检测 AR 的可行性，因此将 AR 选择为 LAR 亚型的 marker（虽然 AR 在 LAR 亚型中的 ROC 只排名第五）
   3. 在 MES 亚型中 ANK2 和 DCLK1 是排名前二的两个基因，作者在石蜡包埋的样本中检测了这两个基因，发现 ANK2 在肿瘤细胞和肿瘤基质中都有不规则的染色，因此比较难定量，而 DCLK1 主要在肿瘤细胞的细胞质中有染色，因此较好识别和定量，并且也有研究表明 DCLK1 基因在乳腺癌细胞系中起到了促进转移的作用并且在多种癌症类型中被视作癌干细胞的标志，所以选择 DCLK1 作为 MES 亚型的 marker

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使用 IHC 检测定量这些基因表达的细节：AR, FOXC1 和 DCLK1 主要在肿瘤细胞中表达，因此这三个基因的蛋白表达水平定义为阳性肿瘤细胞的比例（阳性肿瘤细胞的数量除以总肿瘤细胞的数量），所有含有肿瘤的侵袭区域都包含用来计算；CD8 主要在肿瘤浸润淋巴细胞中发现，因此 CD8 的蛋白水平定义为为阳性细胞的比例（阳性细胞的数量除以所有类型细胞的数量），对所有侵袭性肿瘤区域都包括进行计算，包括肿瘤和基质，但未包括肿瘤边缘外的免疫浸润，如三级淋巴结构，坏死区域，挤压伪影以及肿瘤区域内的核心活检部位也未包括。

作者首先利用 TCGA 作为额外验证集（利用前一篇文章中的最近收缩质心法对 TCGA 样本进行分类），检测了上面筛选出来的 4 个基因在不同亚型中的表达差异以及区分不同亚型的能力：

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接着在 210 个 TNBC 样本中进行免疫组化分析，检测这 4 个基因的表达水平，并比较不同亚型中这四个基因的免疫组化表达水平的差异以及区分不同亚型的能力：

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接下来就使用这 4 个 marker 基因将 210 个 TNBC 分成不同的亚型，首先根据 4 个 marker 分辨各自亚型的 AUC 值进行排序，从而得到不同 marker 在分类中的优先级（即 AR, CD8A, FOXC1, DCLK1）；然后再依据约登指数（Youden’s index）来判断这四个 marker 的阈值：

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Youden’s index 等于 Sensitivity + Specificity − 1，在 ROC 图上可以表示为：

即 Sensitivity - (1-Specificity) 也就是这个竖线的长度，这个竖线在 ROC 曲线的拐点处最大

因此 AR, FOXC1 和 DCLK1 的阳性阈值都是大于 10%，而 CD8A 的阈值为大于 20%，利用这些阈值可以将 TNBC 样本分成五类：

• IHC-LAR，AR 阳性 (+)
• IHC-IM，AR 阴性 (-)，CD8 阳性（+）
• IHC-BLIS，AR 阴性 (-)，CD8 阴性（-），FOXC1 阳性 (+)
• IHC-MES，AR 阴性 (-)，CD8 阴性（-），FOXC1 阴性 (-)，DCLK1 阳性 (+)
• IHC-unclassifiable (IHC-UC)，四个全阴性

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使用 Cohen κ 系数 （见 kappa）来评估基于 IHC 的分型和基于 mRNA 的分型之间的一致性，总体上两个分类系统的 cohen 系数为 0.678，被两种方法归类为同一个亚型的样本占比为 76.7%，两种方法间最匹配的亚型分类的 LAR 亚型：

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接下来作者比较了不同 IHC 分型的预后差异，并且使用两个额外的验证集进一步验证了这种预后差异，还发现使用分型结合 TN 分期可以较好预测复发。另外在 BLIS 亚型中除了之前文章里面发现的 HRD 特征之外，还发现 VEGF signature 在该亚型中也是比其他亚型更加活跃的，这一结果提示抗血管生成治疗可能是 IHC-BLIS TNBC 患者的一种选择。

Metabolic-Pathway-Based Subtyping of Triple-Negative Breast Cancer Reveals Potential Therapeutic Targets -- Cell Metabolism

主要发现：

• 基于代谢通路将 TNBC 样本分成了三个亚类
• 通过额外 72 个样本的代谢谱对这些亚类进行了验证
• 鉴别了三个代谢亚型的潜在靶点：MPS1 对脂肪酸合成代谢抑制剂敏感，MPS2 对糖酵解抑制剂敏感，另外在 MPS2 中通过抑制乳酸脱氢酶可以增强抗 PD1 免疫检查点抑制剂效果

这篇文章所用的样本还是之前文献里面的 465 个，包括 360 个表达谱。

转录组图谱揭示了 TNBC 中的代谢失调

KEGG 数据库中的 86 个代谢通路，共包括 1660 个基因。

在 Oslo2 中检测了 mRNA 表达和蛋白表达之间的关系，发现 73% 的基因有着显著的正相关，说明可以用 mRNA 的表达来近似蛋白的表达水平

对这些代谢相关基因的表达进行 PCA 分析，发现 TNBC 可以和非 TNBC 以及正常样本分开，并且发现非 TNBC 的癌症样本和正常样本更加相似，说明三阴性乳腺癌的代谢模式和其他乳腺癌以及正常组织有着较大的差异。

用欧式距离和相关距离（1 - Spearman 相关系数）来定量 TNBC 样本之间，TNBC 和配对的正常样本的差异，并用正常样本之间的差异作为阴性对照，发现 TNBC 与相应的正常组织之间或在 TNBC 样本之间的表达距离明显大于正常样本之间的表达距离

使用 GSEA 来分析 TNBC 相对于正常样本失调的代谢通路，发现了 21 个代谢通路是显著失调的（18 个上调，3 个下调）。氧化磷酸化和嘧啶代谢是上调最多的两个代谢通路；失调的通路覆盖了主要的代谢过程；进一步利用 differential rank conservation （见 Differential Rank Conservation (DIRAC) Analysis） 分析来看通路在肿瘤和正常组织中的变异程度，发现肿瘤组织的 RCI （rank conservation indexes）更低，说明这些通路在肿瘤中的异质性更大：

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基于代谢通路的 TNBCs 样本分层

对 360 个有着转录组数据的样本用 GSVA 计算了 86 个通路的富集分数，利用一致性聚类发现最佳聚类数为 3，然后用 k-means 聚类基于 GSVA 的富集分数将样本聚成 3 类：

三类描述为：

• MPS1，占比 26.4%，lipogenic subtype，特征是脂代谢的上调
• MPS2，占比 36.9%，glycolytic subtype，特征是碳代谢和核苷酸代谢，包括 TCA，糖酵解，嘌呤和嘧啶代谢
• MPS3，占比 36.7%，mixed subtype，主要的代谢通路类型都发生了失调

这三类的肿瘤纯度（ASCAT 得到）和肿瘤/基质细胞的比例（HE 染色图片得到）都没有显著差异（避免是正常细胞的影响导致三类的不同）。

这三个亚型在临床上也有一些差异：MPS1 患者年龄较大，腋窝淋巴结阳性率较高，而 MPS2 的肿瘤分级较高（p < 0.001）；MPS2 的无复发生存率比其他两个亚类显著更差，使用 Cox 分析在控制了其他的变量后仍然是更差预后的预测因素：

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基于代谢通路的分型展示了独特的代谢特征

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上图展示了三个代谢亚型中的主要代谢基因相比较正常组织的差异。接着为了比较不同亚型代谢物的丰度，作者对 72 个样本进行了非靶向代谢组分析，这些样本也有匹配的转录组数据，共注释出 594 个代谢物，基于这些代谢物丰度对样本进行 PCA 分析，还是可以大致分开的：

对不同的亚型进行代谢物的差异分析，发现 MPS1 确实有着多种脂质代谢物的积累，MPS2 的葡萄糖水平较低，葡萄糖是糖酵解代谢的底物，而其他几种糖酵解和核苷酸代谢的中间物水平都有所上升：

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接着作者对 MPS1 和 MPS2 进行了 DA 分析（Differential Abundance），结论类似：

DA 分析衡量了一个通路中的代谢物的平均总变化，计算方法为：首先对所有代谢物在两组间进行差异分析，使用的方法为 Mann-Whitney 检验并进行多重假设检验校正，然后对该通路计算：

DA = \frac{\#Increase -\#Decrease}{\#Total}

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不同代谢亚型的基因组变异特征

使用有匹配 WES （243 ）和拷贝数变异数据（302）的样本检测了不同代谢亚型的基因组变异特征：

• MPS2 有着更高的 CNA 负担和染色体不稳定性水平
• 在 10 个原癌基因信号通路中，看不同亚型的变异比例（至少在某个通路中有一个变异的样本比例），发现 MPS1 亚型中 PI3K 和 RTK-RAS 有着更高的突变比例，MPS2 中有着更高的细胞周期和 HIPPO 扩增比例，所有亚型在这 10 个通路中都没有显著的删除差异
• 亚型特异的突变基因，MPS1 中 PI3K （包括 PI3KCA,PIK3R1,PTEN）和 RTK-RAS （包括 ERBB2, HRAS）通路的基因有着最高的突变频率（和其他亚型比较），并且在多重假设检验校正后 PI3KCA 和 PTEN 仍是显著的；MPS2 有着更频繁的拷贝数变异，特别在染色体 12p12.1–12p13.3 处的扩增，包含了几个糖酵解相关的基因，包括 ENO2, GAPDH, LDHB, 和 TPI1，表明这个位置的变异可能调控了肿瘤细胞的糖酵解活性

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不同的代谢亚型表现出对代谢抑制剂独特的敏感性

对 CCLE 中的 24 个 TNBC 细胞系使用了最近收缩质心法（第一篇文献中的方法）将细胞系分为上述的三个代谢亚型，然后做了 FA uptake 实验，发现 MPS2 有着更高的 FA uptake；使用氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）来测量线粒体呼吸和糖酵解活力，发现 MPS1 细胞系比其他细胞系有着更高的氧消耗率和更低的糖酵解速率；ATP 合酶依赖的氧消耗和 ECAR 的比例可以用来指示肿瘤细胞的糖酵解偏好性（这个比值越低说明糖酵解活性越高），发现 TNBC 细胞系的糖酵解偏好性的变化比较大，其中 MPS2 细胞系有着最高的糖酵解偏好：

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基于这些发现，MPS1 细胞应该对靶向脂肪酸合成的抑制剂敏感（cerulenin 和 C75），而 MPS2 细胞则对靶向糖酵解的抑制剂敏感（oxamate, 2-deoxy-D-glucose 和 GNE-140, FX-11）

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上面的实验都属于短时期的 viability assays（细胞生存能力测定实验），因此作者也做了长时间的克隆形成实验，结果是类似的：

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患者来源的类器官（PDO）模型，保留了原发肿瘤的分子和细胞组成，已被报道在个性化癌症治疗中具有优势，特别是在临床前药物筛选中，因此作者在 5 个 TNBC PDO 模型中（2 个 MPS1, 2 个 MPS2 和 1 个 MPS3）进行了细胞存活实验，使用了 FASN 抑制剂 （C75）和 LDH 抑制剂（GNE-140 ，FX-11），发现 C75 在 MPS2 的 PDO 中的 IC50 确实更低，而 GNE-140 和 FX-11 的 IC50 在 MPS2 的 PDO 中更低（GNE-140 貌似效果不是很好）：

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MPS2 亚型使用抗 LDH 治疗后对免疫检查点抑制剂治疗敏感

之前的研究表明肿瘤细胞中的乳酸产生增多可以抑制微环境中的 T 细胞和 NK 细胞对肿瘤细胞的免疫监视，从而促进肿瘤的生长（参考文献 LDHA-Associated Lactic Acid Production Blunts Tumor Immunosurveillance by T and NK Cells）。糖酵解通路的富集分数和免疫杀伤活力（GZMA 和 PRF1 基因表达的几何平均）以及 CD8 T 细胞和 NK 细胞的 marker 基因的表达都是负相关的，因此提出假设：在肿瘤细胞中上调的糖酵解抑制 T 细胞和 NK 细胞的免疫功能，从而使用 LDH 抑制剂可以是的这类 TNBC 细胞对免疫治疗敏感：

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挑选了 3 个 TNBC 的鼠细胞系，分别对应三个代谢亚型（TS/A 对应 MPS1, 4T1 对应 MPS2, 66cl4 对应 MPS3），在体外进行了和之前类似的药物实验，也和之前的结果类似，从而验证了这几种细胞系的代谢亚型归属是可靠的：

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接下来作者进行了联合用药的体内实验，结合 LDH 抑制剂 FX-11 和免疫检查点抑制剂（抗 PD-1），发现单独用两个药对 4T1 的肿瘤生长没有作用，但是联合用药可以显著抑制肿瘤的生长，同时在其他两个细胞系中没有观测到这种现象：

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同时使用流式来分析肿瘤组织的免疫浸润细胞，发现联合用药的小鼠的肿瘤有着显著增多的 CD8 和 NK 细胞浸润，并且产生 IFN-R 和颗粒酶 B 的 CD8 T 细胞和 NK 细胞比例都显著升高：

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和之前文章一样，也有一张表总结不同代谢亚型的特征：

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Subtyping-based platform guides precision medicine for heavily pretreated metastatic triple-negative breast cancer: The FUTURE phase II umbrella clinical trial -- Cell Research

Umbrella clinical trial：伞状临床实验，对入组的患者基于生物标志物分配不同的治疗策略：

本文就是采用伞状临床实验来探索基于分型的治疗策略是否会改善转移性 TNBC 病人的预后，并探索潜在的生物标志物：

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TNBC 对化疗的反应率只有 5%~10%（later-line）

近年来，免疫治疗成为 TNBC 治疗的一项突破性进展，PARP 抑制剂也为携带 BRCA 种系突变的病人带来了显著的获益；但是缺乏足够的证据表明在 later-line 的治疗（转移的 TNBC）中免疫治疗可以有较好的疗效，另外 BRCA 种系突变在转移的 TNBC 中也比较少

在 2018 年到 2022 年之间选了 141 个病人入组，依据 NGS panel 和 IHC 检测将病人进行分型，依据不同的分型给予不同的治疗策略（treatment arms）：

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总体的病人情况，最终有 9 个病人还在继续接受相应的治疗（对应上面四个 treatment arms）：

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RECIST 评价标准：

完全缓解(Complete response，CR)：所有肿瘤靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。

部分缓解(Partial response, PR)，肿瘤靶病灶最大径之和减少≥30%，至少维持4周。

病变稳定(Stable disease, SD)，肿瘤靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD。

病变进展(Progressive disease, PD)，肿瘤靶病灶最大径之和至少增加≥20%，或出现新病灶。

客观缓解率（Objective response rate，ORR），肿瘤体积缩小达到预先规定值并能维持最低时限要求的患者比例，为完全缓解（CR）和部分缓解(PR)比例之和，ORR=CR+PR。

疾病控制率（Disease control rate，DCR），经治疗后获得缓解（PR+CR）和病变稳定（SD）的病例数占可评价例数的百分比，DCR=CR+PR+SD。

在 42 个病人中实现了 OR， 在 68 个病人中实现了 DC

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达到疗效界限和未达到疗效界限的治疗组

该研究使用了贝叶斯预测概率（参见 使用贝叶斯预测概率来进行中期分析 ） 来设计临床试验以及评估有效和无效的终点。计划筛选 200 至 300 名现有治疗失败的难治性 TNBC 患者，基于不同的分型设置 7 个治疗组，每个治疗组为 10-20 例患者。因此研究共纳入了约 140 例患者；每组 20 例病人中达到 CR 或 PR 的患者有 3 例或以上被定义为达到研究终点。使用贝叶斯方法来设计临床试验的好处是允许 arm 是实时动态的，旧的 arm 就可以在完成时被移除，然后可以添加新的 arm。

作者设置了参考的响应率为 15%，概率阈值为 0.5，先验分布为 Beta(0.05, 0.05)（这个先验比较 weak，期望为 0.5），也就是说响应率大于 0.15 的后验概率大于 0.5，那么就认为这个试验是成功的，那么就可以利用贝叶斯预测概率方法来进行中期分析，判断需不需要继续进行试验，作者定义预测的概率如果小于 0.1 就认为无效而停止试验，预测概率大于 0.9 则认为有效而停止试验，基于这个规则可以计算不同入组病人数对应的失败界限和有效界限：

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举个例子，当中期分析时病人数目为 14，依据之前的推文中写的函数来计算相应的预测概率：

### 1 个病人有效
get_p(alpha = 0.05, beta = 0.05, 
   interim_N = 14, interim_x = 1,
   future_N = 6, sample_counts = 1000, 
   threshold = 0.15,
   p_threshold = 0.5)
#[1] 0.023
### 2 个病人有效
get_p(alpha = 0.05, beta = 0.05, 
   interim_N = 14, interim_x = 2,
   future_N = 6, sample_counts = 1000, 
   threshold = 0.15,
   p_threshold = 0.5)
#[1] 0.237
### 3 个病人有效
get_p(alpha = 0.05, beta = 0.05, 
   interim_N = 14, interim_x = 3,
   future_N = 6, sample_counts = 1000, 
   threshold = 0.15,
   p_threshold = 0.5)
#[1] 0.708
### 4 个病人有效
get_p(alpha = 0.05, beta = 0.05, 
   interim_N = 14, interim_x = 4,
   future_N = 6, sample_counts = 1000, 
   threshold = 0.15,
   p_threshold = 0.5)
#[1] 1

也就是按照 0.1 和 0.9 的阈值判断，小于等于 1 个病人有效时这个试验就无需进行了，直接认定失败而终止，当大于等于 4 个病人有效时，这个试验也无需进行了，直接认定成功而终止

依据上面的实验设计，A, C, E 和 G 治疗组达到了有效界限从而可以终止试验。这些治疗组中有 61% 的病人实现了肿瘤的缩小：

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另外治疗组 B, D 和 F 没有达到有效界限。

BLIS 和 LAR 亚型可能从 ADC 治疗中获益

作者接下来探索了 ADC 药物对 BLIS 和 LAR 亚型的治疗效果，在乳腺癌中两种 ADC 药物展现了比较大的前景，分别为 anti-HER2 和 anti-Trop-2 ADC。

ADC 是抗体偶联药物是一类融合了抗体与小分子细胞毒素两种组分的新兴药物，其中抗体提供细胞靶向性，可以将药物比较精准的输送到靶细胞，最大限度地减少对正常组织细胞的毒性

在之前的 360 个病人的队列中发现 LAR 亚型的 ERBB2 表达（mRNA 和蛋白层面）都显著高于其他亚型，提示 LAR 亚型的病人可能会从 anti-HER2 ADC 药物中受益；另外在 BLIS 和 LAR 亚型中，TACSTD2 的表达也高于其他亚型（这个基因编码 Trop-2 蛋白），提示这两个亚型可能会从 anti-Trop-2 ADC 中获益。接下来作者在细胞系和病人来源的 PDO 中进行了药物实验（RC48 和 sacituzumab govitecan，SG）。

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Molecular classification of hormone receptor-positive HER2-negative breast cancer -- Nature Genetics

这篇文章主要发现：

• 绘制了 HR+/HER- 乳腺癌多组学图谱，解析了其异质性
• 将 HR+/HER- 乳腺癌分成 canonical luminal, immunogenic, proliferative 和 receptor tyrosine kinase (RTK)-驱动的亚型，并鉴别了潜在的治疗靶点
• 开发了卷积神经网络模型从病理图片来预测上述的乳腺癌分型

乳腺癌可以根据不同的激素受体（HRs，包括雌激素和孕激素受体）以及人表皮生长因子受体（HER2）的状态分为不同的亚型，其中 HR+/HER- 的亚型占比最高，大概占 2/3（前面的文章都是聚焦三阴性乳腺癌）。虽然这些肿瘤对激素治疗比较敏感，但是在5年的计划激素治疗期间，存在远处复发的持续风险。复发率在诊断和治疗后的前 4-6 年最高，但风险不会降到 0，在诊断后的 20-30 年后仍然保持较高水平。

这篇文章的思路：

1. 对 579 个 HR+/HER- 乳腺癌进行了多组学图谱的绘制；

2. 基于拷贝数变异，mRNA 表达以及代谢物的丰度对 351 个样本进行多组学聚类，使用的方法为相似网络融合（similarity network fusion，SNF）识别出最佳聚类数为 4 类；

   SNF 现对每个组学数据构建一个样本相似性网络，然后利用网络融合技术构建一个多组学相似性网络，接着在该网络上进行谱聚类

3. 对每类的基因组特征进行描述，并对类之间进行差异分析，找到富集的通路

4. 不同亚型的代谢通路的 dysregulated 情况，将一些基因的变异状态与代谢物丰度进行关联性分析

5. 不同亚型间的临床特征比较

6. 构建 CNN 模型基于病理染色图片对这四个亚型进行预测

7. 探索不同亚型潜在的治疗靶点

   1. SNF3 亚型中细胞周期相关的通路上调，并且 HRD 和染色体不稳定 score 也上升，并在 PDO 上验证了相关药物的效果（CDK4/CDK6 抑制剂 abemaciclib 以及 PARP 抑制剂 olaparib）

   2. SNF2 中免疫细胞比例以及杀伤性因子表达，T 细胞受体基因多样性都升高，并且一些免疫检查点生物标志物的水平也升高（TIS score，STAT1 以及 PDCD1）,这类病人可能对免疫检查点抑制剂敏感

   3. SNF4 中 RTK 通路激活，并且 SNF4 中 CAFs 细胞的比例上升，而 RTK 可能在肿瘤细胞或者基质细胞中表达，因此作者假设 RTK 在 CAF 细胞中激活，增强其功能，CAF 进一步促进肿瘤进展，导致这类病人预后最差。通过单细胞分析，磷酸蛋白质组学以及 WB 实验，发现 PDGFRA和 EGFR （常见的 RTKs）在 SNF4 肿瘤样本中高表达和高磷酸化，特别是在 SNF4 的 CAFs 中；接着作者分别从 SNF1 和 SNF4 样本中分离肿瘤细胞，然后和来自 SNF4 的 CAF 共培养，发现可以显著促进 SNF1 和 SNF4 的肿瘤细胞生长，说明 CAF 丰度可能是造成 SNF4 亚型更恶性的机制之一；接着加上 RTK 抑制剂 sorafenib 之后可以抑制肿瘤细胞生长，提示 SNF4 可能对 RTK 抑制剂敏感：

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